正在(zài)試運行中
AFADESI-MSI是(shì)一(yī / yì ／yí)種新型的(de)常壓敞開式離子(zǐ)化技術，無需放射性同位素或熒光标記，通過與高分辨質譜儀聯機使用，可直觀反映目标分子(zǐ)或者未知化合物分子(zǐ)在(zài)生物體内的(de)原位代謝信息，能夠解決具有空間分布差異或者結構差異相關的(de)生物學問題。該技術借助于(yú)高速的(de)空氣流，實現了(le／liǎo)離子(zǐ)的(de)遠距離傳輸，擴展了(le／liǎo)待測樣品的(de)檢測空間和(hé / huò)靈活性，靈敏度可達pg級别，動态範圍達到(dào)三個(gè)數量級，覆蓋1500個(gè)化合物，如膽堿類、多胺類、氨基酸類、肉堿類、核苷類、核苷酸類、有機酸類、碳水化合物類、膽固醇類、膽酸類、脂質類等多種類代謝物。
中國(guó)醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國(guó)家重點實驗室再帕爾·阿不(bù)力孜、賀玖明團隊在(zài)分析化學一(yī / yì ／yí)區《Analytical Chemistry》期刊發表封面文章，題爲(wéi / wèi)“Mapping Metabolic Networks in the Brain by Ambient Mass Spectrometry Imaging and Metabolomics”的(de)研究成果，采用自主研發的(de)AFADESI-MSI技術，建立了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)種高靈敏空間代謝組學方法，實現了(le／liǎo)大(dà)鼠腦組織中多種類極性内源性代謝物的(de)高覆蓋成像，結合代謝通路分析，全面繪制腦代謝網絡圖譜，揭示了(le／liǎo)東莨菪堿緻大(dà)鼠記憶功能障礙模型的(de)代謝改變及其腦微區分布特征。（文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00467）
大(dà)腦功能與其複雜的(de)微區結構密切相關。研究腦中分子(zǐ)變化有助于(yú)理解中樞神經系統疾病的(de)發病機制，推動藥物研發。質譜成像(MSI)技術具有高靈敏、方便、省時(shí)以(yǐ)及免标記的(de)優勢，已成爲(wéi / wèi)繪制蛋白質、代謝産物和(hé / huò)脂質圖譜的(de)強大(dà)工具，但高通量成像表征腦中的(de)極性小分子(zǐ)代謝物仍具挑戰。本文對課題組研發的(de)空氣動力輔助離子(zǐ)化質譜成像（AFADESI-MSI）平台進行了(le／liǎo)優化，應用空間分辨代謝組學繪制了(le／liǎo)大(dà)鼠腦代謝網絡。
SD大(dà)鼠腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿（給藥組、對照組各3隻），安樂死後取出(chū)大(dà)腦，用冷凍切片機制成20 μm厚的(de)矢狀切片，相鄰的(de)大(dà)腦切片進行H&E和(hé / huò)Nissl染色。
SD大(dà)鼠腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿（給藥組、對照組各3隻），安樂死後取出(chū)大(dà)腦，用冷凍切片機制成20 μm厚的(de)矢狀切片，相鄰的(de)大(dà)腦切片進行H&E和(hé / huò)Nissl染色。
原始數據轉換後應用MassImager軟件進行可視化。将光學圖像精準匹配感興趣區域的(de)離子(zǐ)強度，獲取差異代謝物信息。通過在(zài)線數據挖掘工具Metaboanalyst完成了(le／liǎo)代謝物的(de)高通量注釋。Cyctoscape用于(yú)可視化大(dà)腦中的(de)複雜網絡。
兩組大(dà)腦樣本選擇相同的(de)微區進行組織學特征性離子(zǐ)圖像疊加，采用t檢驗(n = 3)進一(yī / yì ／yí)步驗證數據處理結果。
研究通過優化實驗确定ACN / H2O（8:2）作爲(wéi / wèi)理想的(de)噴霧溶劑。圖像中小腦小葉間隔（約爲(wéi / wèi)78.0 μm）清晰可見，表明AFADESI-MSI的(de)實際空間分辨率小于(yú)100 μm。此外，成像結果顯示質量差爲(wéi / wèi)30ppm的(de)兩種代謝物可以(yǐ)得到(dào)明顯分離，檢測的(de)動态範圍高達1000倍。如圖所示，通過AFADESI-MSI獲得的(de)一(yī / yì ／yí)些具有代表性的(de)代謝物，離子(zǐ)強度從0~106，其分布特征與腦功能結構高度一(yī / yì ／yí)緻。
圖1. AFADESI-MSI和(hé / huò)代謝組學繪制大(dà)鼠大(dà)腦代謝網絡的(de)策略，以(yǐ)及代表性極性内源性代謝物離子(zǐ)圖像。
實驗通過AFADESI-MSI在(zài)正負離子(zǐ)模式下獲得了(le／liǎo)298和(hé / huò)372個(gè)特征離子(zǐ)圖像。包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、脂肪酸和(hé / huò)神經遞質（NTs）等。結果顯示γ-氨基丁酸（GABA）在(zài)中腦、嗅球和(hé / huò)下丘腦中信号強度較高；多巴胺（DA）主要(yào / yāo)集中分布在(zài)紋狀體；組胺（HA）作爲(wéi / wèi)一(yī / yì ／yí)種興奮性NTs集中在(zài)丘腦和(hé / huò)下丘腦中。松果體在(zài)睡眠和(hé / huò)光周期調節方面起着重要(yào / yāo)的(de)作用，由于(yú)其體積小容易被忽視。實驗在(zài)該區域檢測到(dào)共106種極性代謝物，發現吲哚乙醛、吲哚、5'-甲基硫代腺苷和(hé / huò)褪黑素高表達，且褪黑素上(shàng)遊代謝産物血清素(5-HT)在(zài)松果體中也(yě)有特定的(de)分布。
圖2.AFADESI-MSI和(hé / huò)MetaboAnalyst獲得的(de)大(dà)鼠腦中的(de)代謝網絡。
研究将光學圖像和(hé / huò)MSI圖像進行精确疊加，從大(dà)腦微區中提取代謝圖譜進行代謝網絡重構。圖中顯示了(le／liǎo)包括谷氨酸代謝、花生四烯酸代謝、葡萄糖代謝、嘌呤代謝、三羧酸循環等在(zài)内的(de)代謝途徑。這(zhè)些信息有助于(yú)在(zài)系統水平上(shàng)深入了(le／liǎo)解大(dà)腦的(de)代謝活動。如圖3A所示，嘌呤代謝中，AMP和(hé / huò)GMP在(zài)大(dà)腦皮層和(hé / huò)松果體中高表達，但在(zài)胼胝體和(hé / huò)穹隆中強度較弱。這(zhè)些結果表明，代謝物的(de)分布在(zài)大(dà)腦中表現出(chū)功能區域特異性。
圖3.AFADESI-MSI獲得大(dà)鼠腦内嘌呤代謝途徑及相關代謝産物分布(A)和(hé / huò)AMP在(zài)大(dà)鼠腦各層的(de)分布(B)。
如圖展示了(le／liǎo)NTs及其相關代謝物在(zài)大(dà)鼠腦内的(de)分布特征和(hé / huò)聯系。結果表明代謝物在(zài)腦微區結構中的(de)代謝速度是(shì)可變的(de)，并定義了(le／liǎo)區域内穩态的(de)條件。如組氨酸作爲(wéi / wèi)組胺（HA）的(de)前體在(zài)松果體中分布稍高，而(ér)HA僅在(zài)丘腦和(hé / huò)下丘腦中觀察到(dào)；HA代謝下遊産物甲基組胺在(zài)丘腦和(hé / huò)下丘腦中的(de)分布比HA更廣泛，從而(ér)進一(yī / yì ／yí)步證明了(le／liǎo)代謝網絡的(de)區域多樣性和(hé / huò)複雜性。
圖4.(A)神經遞質及其相關代謝物在(zài)大(dà)鼠腦中的(de)分布;(B)神經遞質調節和(hé / huò)代謝網絡。
研究應用AFADESI-MSI分析了(le／liǎo)對照組和(hé / huò)東莨菪堿治療的(de)大(dà)鼠腦矢狀切片。顯示了(le／liǎo)差異代謝物在(zài)不(bù)同腦微區的(de)含量，如N-甲酰犬尿氨酸、L-色氨酸和(hé / huò)5-HTP這(zhè)三種代謝物同屬于(yú)色氨酸代謝通路，表明東莨菪堿擾亂了(le／liǎo)腦區色氨酸代謝過程或相關代謝物的(de)區域間轉運。此外，NTs調節網絡也(yě)受到(dào)了(le／liǎo)幹擾，腦導管内HA和(hé / huò)甲基組胺升高， GABA、Glu、谷胱甘肽也(yě)發生變化。對給藥組大(dà)腦的(de)10個(gè)微區進行了(le／liǎo)分析，結果在(zài)腦橋中發現16個(gè)異常代謝物，而(ér)在(zài)大(dà)腦皮質中發現7個(gè)異常代謝物，表明腦橋和(hé / huò)大(dà)腦皮質可能是(shì)對東莨菪堿作用最敏感的(de)區域。
圖5.東莨菪堿模型大(dà)腦中代謝網絡改變。
如下圖所示，顯示了(le／liǎo)其中幾種異常表達的(de)代謝産物的(de)分布，如腺嘌呤在(zài)小腦皮層發生顯著下調;HA在(zài)腦導水管下調 (圖6A-H)。這(zhè)些代謝物的(de)相對定量信息進一(yī / yì ／yí)步表明，藥物效應在(zài)大(dà)腦中具有多樣性和(hé / huò)區域特異性。基于(yú)空間分辨的(de)代謝組學爲(wéi / wèi)發現酶或基因異常提供了(le／liǎo)線索，但要(yào / yāo)完成完整的(de)代謝網絡分析需要(yào / yāo)在(zài)蛋白質和(hé / huò)基因水平上(shàng)進一(yī / yì ／yí)步驗證。
圖6.東莨菪堿治療大(dà)鼠學習記憶障礙腦模型的(de)AFADESI-MSI圖像和(hé / huò)代謝物統計結果(n = 3)。
本研究開發了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)種針對極性内源性代謝小分子(zǐ)高靈敏、高覆蓋的(de)分子(zǐ)成像方法，通過AFADESI-MSI空間代謝組學分析，全面繪制了(le／liǎo)腦代謝網絡及其空間分布，無需衍生化和(hé / huò)複雜的(de)前處理，實現了(le／liǎo)對NTs、核苷酸代謝物、多胺、肌酸等極性分子(zǐ)的(de)可視化，爲(wéi / wèi)腦中生理、病理和(hé / huò)藥理過程的(de)機制、功能、以(yǐ)及神經系統中各區域間的(de)相互聯系提供了(le／liǎo)線索和(hé / huò)代謝網絡調控研究的(de)新視角。本文運用該方法進一(yī / yì ／yí)步研究了(le／liǎo)東莨菪堿模型腦的(de)微區代謝變化，結合統計分析，揭示了(le／liǎo)與記憶功能障礙直接相關的(de)代謝通路顯著改變及其微區分布特征。
數據來(lái)源：“質譜成像”微信公衆号
中國(guó)醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國(guó)家重點實驗室再帕爾·阿不(bù)力孜、賀玖明團隊在(zài)《PNAS》上(shàng)發表了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)篇題爲(wéi / wèi)“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的(de)研究論文，采用AFADESI-MSI技術，建立了(le／liǎo)空間分辨的(de)原位代謝組學方法，并提出(chū)一(yī / yì ／yí)種“下遊代謝物與上(shàng)遊代謝酶關聯” 的(de)研究策略來(lái)表征腫瘤代謝改變；結合免疫組化分析驗證，從代謝物和(hé / huò)代謝酶兩個(gè)層次和(hé / huò)組織原位深入探究食管癌的(de)代謝改變，發現并可視化表征了(le／liǎo)食管癌異常的(de)代謝通路及其代謝酶。（文章鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.1808950116）
獨特的(de)代謝模式是(shì)腫瘤細胞區别于(yú)正常細胞的(de)重要(yào / yāo)特征，越來(lái)越多的(de)研究表明，在(zài)腫瘤的(de)發生、發展過程中，腫瘤細胞會發生特定譜式的(de)代謝改變以(yǐ)适應腫瘤生長。對于(yú)不(bù)同組織來(lái)源的(de)腫瘤細胞，盡管彼此間的(de)基因變異譜千差萬别，但是(shì)，幾乎所有的(de)腫瘤都需要(yào / yāo)通過類似的(de)代謝重編程（Metabolic Reprogramming）來(lái)維持其無限制的(de)細胞增殖。腫瘤代謝的(de)表征能夠爲(wéi / wèi)癌症病理機制研究、腫瘤診療新指标和(hé / huò)幹預靶點的(de)發現提供新的(de)契機。然而(ér)，到(dào)目前爲(wéi / wèi)止，如何全面的(de)發現腫瘤的(de)異常代謝，尤其是(shì)如何從代謝物和(hé / huò)代謝酶兩個(gè)層面上(shàng)原位地(dì / de)表征腫瘤的(de)異常代謝仍然面臨非常大(dà)的(de)困難。
收集256例人(rén)鱗片狀食管癌（ESCC）組織标本，包括癌組織、癌旁組織和(hé / huò)遠端非癌組織，制成冰凍組織切片。如圖1所示，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子(zǐ)化質譜成像技術（AFADESI-MSI），采集上(shàng)述組織中内源性代謝物及其空間分布信息；對相鄰切片進行HE染色；采用MassImager質譜成像數據處理軟件，使質譜成像圖與HE染色圖匹配重合，按不(bù)同組織類型及空間分布提取代謝物輪廓信息；使用SIMCA軟件進行多變量統計分析，篩選出(chū)與腫瘤代謝相關的(de)差異代謝物；根據差異代謝物及其鑒定結果富集分析發生變化的(de)代謝通路及推測關鍵代謝酶；采用免疫組化方法檢測鎖定的(de)代謝酶表達，進一(yī / yì ／yí)步驗證其與代謝标志物是(shì)否具有同樣的(de)空間分布特征。
脯氨酸作爲(wéi / wèi)細胞微環境中的(de)重要(yào / yāo)氨基酸參與細胞凋亡和(hé / huò)自噬，在(zài)癌症代謝中的(de)重要(yào / yāo)作用得到(dào)越來(lái)越多的(de)關注。根據256個(gè)食管癌組織樣本的(de)統計數據，癌區脯氨酸離子(zǐ)強度顯著高于(yú)上(shàng)皮和(hé / huò)肌肉區(P<0.001，圖2C)。采用免疫組化方法檢測與脯氨酸合成相關的(de)關鍵代謝酶吡咯-5-羧酸還原酶2（PYCR2）在(zài)ESCC組織切片中的(de)空間表達，發現PYCR2隻在(zài)癌區表達(圖2e)，與食管癌組織中脯氨酸的(de)空間分布一(yī / yì ／yí)緻。
圖2 脯氨酸生物合成途徑中關鍵代謝物和(hé / huò)代謝酶的(de)原位分析（A）脯氨酸的(de)質譜成像（B）光學-MSI重疊圖像（C）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和(hé / huò)相鄰上(shàng)皮、肌肉組織中脯氨酸水平 ***p<0.001（D）ESCC組織的(de)HE染色圖 （E）不(bù)同ESCC組織中PYCR2的(de)表達 CT，癌組織；ET，上(shàng)皮組織；MT，肌肉組織
尿苷是(shì)RNA合成的(de)重要(yào / yāo)核苷前體，也(yě)參與嘌呤核苷酸生物合成和(hé / huò)碳水化合物代謝。此外，組織中尿苷的(de)水平對于(yú)嘧啶類抗代謝藥物的(de)抗腫瘤治療至關重要(yào / yāo)。研究發現癌組織中尿苷含量高于(yú)上(shàng)皮組織而(ér)低于(yú)肌肉組織（P<0.001,圖3 A1和(hé / huò)A3），而(ér)尿嘧啶的(de)含量在(zài)癌組織中顯著升高（P<0.001,圖3 A2和(hé / huò)A4），尿嘧啶/尿苷離子(zǐ)強度比（圖3A6）在(zài)癌區顯著增加，可以(yǐ)作爲(wéi / wèi)區分癌組織與癌旁正常組織的(de)生物标志物。同樣，免疫組化結果顯示催化尿嘧啶生成尿苷的(de)代謝酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在(zài)癌組織中的(de)表達上(shàng)調。
圖3A 尿苷代謝途徑中關鍵代謝物和(hé / huò)代謝酶的(de)原位分析（A1，A2）尿苷和(hé / huò)尿嘧啶的(de)質譜成像圖 （A3，A4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和(hé / huò)相鄰上(shàng)皮、肌肉組織中尿苷和(hé / huò)尿嘧啶水平 ***p<0.001（A5）UPase 1介導的(de)尿苷轉換爲(wéi / wèi)尿嘧啶的(de)代謝過程（A6）根據尿嘧啶/尿苷離子(zǐ)強度比值構建的(de)質譜成像圖 （A7）癌組織和(hé / huò)相鄰上(shàng)皮、肌肉組織中尿苷和(hé / huò)尿嘧啶的(de)強度變化（A8）ESCC不(bù)同區域UPase 1的(de)表達 CT，癌組織；ET，上(shàng)皮組織；MT，肌肉組織
組氨酸在(zài)組氨酸脫羧酶(HDC)的(de)介導下代謝爲(wéi / wèi)組胺。有越來(lái)越多的(de)證據顯示組胺直接參與緻癌作用，可以(yǐ)作爲(wéi / wèi)一(yī / yì ／yí)種潛在(zài)的(de)細胞保護劑來(lái)改善癌症治療。根據一(yī / yì ／yí)些研究者的(de)說(shuō)法，基于(yú)組胺的(de)治療能促進癌細胞中DNA損傷、凋亡和(hé / huò)衰老并可以(yǐ)顯著增加患癌動物的(de)存活率。在(zài)本研究中，組氨酸和(hé / huò)組胺呈現完全相反的(de)空間分布。根據256例食管癌組織樣本的(de)成像數據，組氨酸在(zài)癌組織中顯著上(shàng)調而(ér)組胺顯著下調。組胺與組氨酸的(de)離子(zǐ)強度差異如圖3B7所示。通過計算組胺與組氨酸的(de)離子(zǐ)強度比，對HDC介導的(de)組氨酸脫羧反應進行了(le／liǎo)研究(3B6)，發現腫瘤組織的(de)脫羧率相對于(yú)肌肉和(hé / huò)上(shàng)皮組織較弱。和(hé / huò)基于(yú)強度比的(de)質譜成像預測的(de)一(yī / yì ／yí)緻，腫瘤組織的(de)HDC表達水平低于(yú)肌肉組織和(hé / huò)上(shàng)皮組織。
圖3B 組胺代謝途徑中關鍵代謝物和(hé / huò)代謝酶的(de)原位分析 （B1，B2）組氨酸和(hé / huò)組胺質譜成像圖（B3，B4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和(hé / huò)相鄰上(shàng)皮、肌肉組織中組氨酸和(hé / huò)組胺水平 （B5）HDC介導的(de)組氨酸轉換爲(wéi / wèi)組胺的(de)代謝過程（B6）根據組胺/組氨酸離子(zǐ)強度比值構建的(de)質譜成像圖（B7）癌組織和(hé / huò)相鄰上(shàng)皮、肌肉組織中組氨酸和(hé / huò)組胺的(de)離子(zǐ)強度變化（B8）ESCC不(bù)同區域HDC的(de)表達。此外，發生改變的(de)代謝途徑還有谷氨酸代謝，脂肪酸合成以(yǐ)及多胺的(de)生物合成，均在(zài)腫瘤組織中表現爲(wéi / wèi)顯著增多，相應的(de)免疫組化結果也(yě)證明與上(shàng)述途徑有關的(de)關鍵代謝酶在(zài)癌區的(de)表達也(yě)明顯上(shàng)調。以(yǐ)下（表1）爲(wéi / wèi)通過256例食管癌患者組織樣本篩選出(chū)的(de)發生改變的(de)6條代謝途徑和(hé / huò)相應的(de)關鍵代謝酶：
表1 篩選出(chū)癌症相關的(de)代謝産物、代謝酶、代謝途徑
該研究建立了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)種高靈敏的(de)空間分辨的(de)原位代謝組學方法，對食管癌潛在(zài)原位标志物進行了(le／liǎo)代謝通路分析，并對通路上(shàng)相關聯代謝物的(de)分布特征進行原位可視化表征，分析其空間變化趨勢，發現了(le／liǎo)并驗證了(le／liǎo)6個(gè)在(zài)食管癌中異常表達的(de)代謝酶：吡咯-5-羧酸還原酶2(PYCR2)、谷氨酰胺酶(GLS)、尿苷磷酸化酶1(UPase1)、組氨酸脫羧酶(HDC)、脂肪酸合成酶(FASN)和(hé / huò)鳥氨酸脫羧酶(ODC)，它們廣泛參與食管癌相關的(de)腫瘤代謝過程，其中PYCR2和(hé / huò)UPase1被首次發現在(zài)食管癌中異常改變。研究結果表明脯氨酸生物合成，谷氨酸代謝，尿苷代謝，組氨酸代謝，脂肪酸合成，多胺生物合成等代謝通路在(zài)食管癌組織中發生了(le／liǎo)顯著變化。這(zhè)些癌症代謝相關信息有助于(yú)增加對癌症代謝重編程的(de)理解。基于(yú)AFADESI-MSI技術的(de)空間分辨原位代謝組學方法，不(bù)僅可驗證腫瘤原位标志物的(de)可靠性；同時(shí)針對腫瘤等具有複雜結構的(de)組織，它具有原位、無需特殊标記、無需複雜耗時(shí)的(de)前處理及反複染色過程，能夠高通量地(dì / de)發現腫瘤異常變化的(de)代謝通路及其代謝酶等優勢；可從代謝物和(hé / huò)代謝酶兩個(gè)層次全面表征腫瘤的(de)代謝改變并發現其潛在(zài)功能，爲(wéi / wèi)深入探究腫瘤的(de)代謝改變提供了(le／liǎo)全新的(de)研究視角。
數據來(lái)源：“質譜成像”微信公衆号
中國(guó)醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國(guó)家重點實驗室再帕爾·阿不(bù)力孜、賀玖明團隊在(zài)《Theranostics》上(shàng)發表了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)篇題爲(wéi / wèi)“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的(de)研究論文，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子(zǐ)化（AFADESI）技術和(hé / huò)基于(yú)人(rén)工神經網絡（ANN）的(de)虛拟校正-定量質譜成像（VC-QMSI）方法，建立了(le／liǎo)針對紫杉醇及其衍生物前藥的(de)體内定量成像方法，爲(wéi / wèi)評估該類藥物的(de)腫瘤靶向效率和(hé / huò)瘤内異質性分布提供了(le／liǎo)直觀有效的(de)途徑，也(yě)爲(wéi / wèi)靶向抗腫瘤新藥研發提供了(le／liǎo)有力的(de)研究工具。（文章鏈接：doi: 10.7150/thno.41763. eCollection 2020.）
可區分正常組織和(hé / huò)腫瘤組織的(de)靶向抗腫瘤藥物開發是(shì)癌症治療研究中的(de)關鍵問題。在(zài)新藥研發的(de)早期，如何快速評估抗癌藥物的(de)腫瘤靶向性非常重要(yào / yāo)，且了(le／liǎo)解藥物在(zài)腫瘤内的(de)異質性分布更具挑戰。開發一(yī / yì ／yí)種高精度、高靈敏度的(de)定量成像分析方法有望解決這(zhè)一(yī / yì ／yí)難題。質譜成像是(shì)一(yī / yì ／yí)種無需标記的(de)分子(zǐ)成像技術，它可提供有關生物體内藥物和(hé / huò)代謝物分布的(de)時(shí)空信息，其在(zài)藥物開發領域的(de)應用正在(zài)迅速增加。紫杉醇具有很強的(de)抗腫瘤活性，但直接用藥常伴随有骨髓抑制、神經毒性等嚴重不(bù)良反應；近年來(lái)臨床緻力于(yú)對紫杉醇進行結構優化、劑型改造或前體藥物開發，以(yǐ)提高藥物的(de)腫瘤靶向能力，減少副作用。本研究建立了(le／liǎo)紫杉醇及其衍生物前藥的(de)體内定量成像方法，評估了(le／liǎo)該類藥物的(de)腫瘤靶向效率和(hé / huò)瘤内異質性分布。
通過構建含已知濃度藥物的(de)模拟生物組織，建立了(le／liǎo)定量質譜成像标準曲線；采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子(zǐ)化質譜成像（AFADESI-MSI）技術，同時(shí)采集藥物、藥物代謝物和(hé / huò)内源性代謝物信息；以(yǐ)内源性代謝物爲(wéi / wèi)内标，結合ANN方法，構建了(le／liǎo)生物組織中質譜響應基體效應自動預測與校正的(de)回歸模型，對動物切片的(de)單位像素進行逐一(yī / yì ／yí)定量，從而(ér)建立了(le／liǎo)整體動物體内藥物質譜成像分析方法。将該方法用于(yú)評估靜脈注射紫杉醇（PTX）、紫杉醇脂質體（PTX-liposome）和(hé / huò)紫杉醇前藥（PTX-R）在(zài)A549細胞異種移植裸鼠中的(de)靶向效率和(hé / huò)瘤内的(de)分布異質性。
該策略的(de)步驟如下：采用含有相同藥量的(de)不(bù)同類型的(de)模拟組織，篩選出(chū)與藥物響應強度變化緊密相關的(de)内源性代謝物，并建立藥物的(de)相對響應強度（相對校正因子(zǐ)RCF）與内源性代謝物離子(zǐ)強度之(zhī)間的(de)ANN模型（圖1A）。根據該模型自動預測整體動物切片中每個(gè)像素的(de)RCF值(RCFpredicted)，并根據公式Intensitycal = Intensity /RCFpredicted獲得校正後的(de)藥物響應強度（Intensitycal）。将校正響應值用于(yú)構建标準曲線，其線性相關系數從未校正的(de)0.45增至校正後的(de)0.99（圖1C）。 使用校正後的(de)标準曲線确定整體動物體内的(de)藥物絕對含量。此外，該方法利用豐富的(de)内源性代謝物質譜信息，通過機器學習可自動識别動物體内的(de)生理分區（圖1D）；它可替代需在(zài)光學或H&E染色指導下的(de)人(rén)工分區方法。綜上(shàng)，VC-QMSI可用于(yú)複雜的(de)整體動物樣本中藥物的(de)空間分辨定量分析（圖1E）。
圖1 VC-QMSI策略在(zài)整體動物組織中準确定位抗腫瘤藥物的(de)過程示意圖 （A）基于(yú)内源性代謝物的(de)機器學習方法預測相對校正因子(zǐ)的(de)示意圖 （B）不(bù)同器官的(de)相對校正因子(zǐ)成像以(yǐ)及相對校正因子(zǐ)預測值和(hé / huò)實測值的(de)比較；縮寫：H心髒，Li肝髒，Sp脾，Lu肺，K腎，Br大(dà)腦，M肌肉，Tu腫瘤 （C）以(yǐ)藥物含量-未校正的(de)藥物響應強度構成的(de)标準曲線和(hé / huò)以(yǐ)藥物含量-校正後的(de)藥物響應強度構成的(de)虛拟校正标準曲線對比 （D）通過使用K均值和(hé / huò)t-SNE聚類分析進行自動像素标記的(de)整體動物分割圖像 （E）整體動物體内藥物定量的(de)可視化結果以(yǐ)及光學圖像
PTX組和(hé / huò)PTX-liposome組：PTX在(zài)動物體内呈廣泛分布，在(zài)心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腸、胃和(hé / huò)腫瘤組織中均有分布；在(zài)健康組織中的(de)含量遠高于(yú)PTX-R組；給藥後期可觀察到(dào)PTX在(zài)胃腸道(dào)中大(dà)量積累，而(ér)在(zài)腎組織中幾乎不(bù)見，提示PTX可能主要(yào / yāo)通過膽汁-糞便途徑排洩。PTX-R組：與前兩組的(de)廣泛分布不(bù)同，PTX-R主要(yào / yāo)分布于(yú)腫瘤組織，其次是(shì)肺和(hé / huò)腸。三組小鼠腦中均沒有明顯的(de)藥物分布。就(jiù)24h内的(de)腫瘤組織藥物暴露量而(ér)言，PTX-R組與PTX-liposome組相當，是(shì)PTX組的(de)2倍；以(yǐ)PTX組爲(wéi / wèi)參比，PTX-R組的(de)相對靶向效率（RTE）是(shì)PTX-liposome組的(de)近50倍。以(yǐ)上(shàng)證明PTX-R有良好的(de)腫瘤靶向能力。
圖2 三個(gè)給藥組在(zài)不(bù)同時(shí)間點的(de)AFADESI-MSI可視圖（A）PTX在(zài)整體動物體内的(de)時(shí)空和(hé / huò)定量分布（B）PTX在(zài)腫瘤組織中的(de)時(shí)空和(hé / huò)定量分布
腫瘤根據形态學的(de)異質性可分爲(wéi / wèi)不(bù)同的(de)微區（圖A，B）。基于(yú)代謝物特征采用t-SNE和(hé / huò)k-means等手段得到(dào)的(de)腫瘤微區自動識别的(de)結果（圖C）與H＆E染色結果（圖A）高度一(yī / yì ／yí)緻。PTX-R在(zài)腫瘤壞死區域和(hé / huò)膠原蛋白區域的(de)含量明顯高于(yú)腫瘤薄壁組織區域（圖D，E, F），表明PTX-R具有出(chū)色的(de)腫瘤穿透能力。對比腫瘤的(de)薄壁組織和(hé / huò)間質區域，PTX-R更多地(dì / de)積累于(yú)腫瘤中未明顯分化的(de)區域，比如腫瘤的(de)膠原蛋白區域和(hé / huò)脂肪組織。這(zhè)種藥物在(zài)腫瘤微區分布的(de)異質性值得進一(yī / yì ／yí)步研究，它對于(yú)認識腫瘤的(de)生長、侵襲、對藥物的(de)敏感性以(yǐ)及預後均有重要(yào / yāo)作用。
圖3 PTX-R在(zài)瘤内的(de)異質分布（A）腫瘤組織的(de)H＆E染色圖像（B）放大(dà)倍數（×20）的(de)代表性腫瘤微區（C）基于(yú)代謝物譜的(de)腫瘤微區的(de)t-SNE空間分布（D）PTX-R在(zài)腫瘤微區中的(de)分布（E）藥物離子(zǐ)成像和(hé / huò)H＆E染色成像之(zhī)間的(de)耦合匹配疊加圖（F）腫瘤微區中PTX-R的(de)定量分布
采用無需标記的(de)AFADESI和(hé / huò)VC-QMSI技術成功建立了(le／liǎo)針對紫杉醇及其前藥的(de)定量質譜成像方法，評估了(le／liǎo)該類抗腫瘤藥物的(de)腫瘤靶向效率和(hé / huò)瘤内分布異質性，并提供了(le／liǎo)直觀的(de)實驗證據表明設計的(de)紫杉醇前藥具備優異的(de)腫瘤蓄積能力和(hé / huò)低全身毒性。進一(yī / yì ／yí)步證明AFADESI-MSI技術具有高靈敏和(hé / huò)寬覆蓋的(de)特點，可在(zài)整體動物的(de)體内微區同時(shí)可視化各種類型的(de)藥物、代謝物和(hé / huò)内源性代謝物。VC-QMSI方法将内源性代謝物作爲(wéi / wèi)内标，建立ANN模型；根據模型預測每個(gè)像素的(de)RCF值，并校正藥物離子(zǐ)強度，從而(ér)實現藥物在(zài)整體動物和(hé / huò)亞器官組織中的(de)定量可視化。紫杉醇前藥及其代謝物的(de)體内定量分布研究有助于(yú)從藥物的(de)保留、消除、靶向和(hé / huò)釋放四個(gè)角度設計有效的(de)腫瘤靶向藥物。所建方法有助于(yú)預測與藥物分布相關的(de)藥效和(hé / huò)安全性，在(zài)抗腫瘤藥物研發早期進行直接快速的(de)藥效篩查，減少損耗、降低成本。此外，本研究對闡明藥物的(de)功效、毒性和(hé / huò)耐藥性提供了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)個(gè)深入的(de)視角，有助于(yú)抗腫瘤藥物的(de)設計和(hé / huò)優化。
數據來(lái)源：“質譜成像”微信公衆号
